Double Stain

ISH+IHC 二重染色検討

STEP1

抗体の選択

ISH反応・発色後にIHCの反応・発色を行う事になります。

2重染色が出来る可能性のある抗体は、染色プロトコールの抗原腑活化処理として熱処理を行う抗体が前提となります。
二重染色には、これに加えて、ISHで行うProteinase K処理を行った切片でシグナルが得られない抗体は使用できません。

STEP2

単染色の確認

まずはそれぞれが単染色で染まる事を確認します。

  • ISHの染色検討を実施し、特異性のある発色を確認する。
  • IHCの染色検討を実施し、抗体特異的な発色を確認する。

STEP3

二重染色検討

STEP2までの確認が取れましたら、ようやく二重染色の検討に入ります。

  • IHC検討用のISH反応を行った切片を大量に用意します。

用意した切片を用いて、まずは、STEP2で決定した条件でIHCを実施し、抗体特異的な発色が得られる条件を確認しますが、これで特異的な発色が得られない場合は、再度、検討を行います。ここまでで検討予備実験が終了します。

STEP4

ISH実施(画像撮影)

STEP3で発色が確認が出来ましたら、ようやく二重染色の本染色を行う事となります。

  • 最初にISHを実施し、発色が確認できた段階で発色部位の画像を撮影します。

ISH

後戻りは出来ないので、予め、IHCと発色が重なる事が予想されるかなりの発色部位の画像を撮影する事となります。

※この段階で画像を撮影しないでSTEP5に進む場合もありますが、発色が重なる事でISHの発色が分りにくい場合が有ります。

STEP5

IHC実施(画像撮影)

STEP4の切片を使用し、IHCを実施する。

画像を撮影します。

ISH_IHC

※この画像だけですと抗体によっては、ISH(青色)の発色部位が塗りつぶされてISHの発色がわかりにくくなります。

作業工程期間

上記のSTEP4~STEP5の反応工程(画像撮影含む)で約2週間を要します。

提出画像

2点の画像を提出させて頂きます。

ISHISH+IHC

2枚の画像を示す事で塗りつぶされているISHの発色部位もわかりやすく示す事が出来ます。

※ISH(NBT/BCIP:青)、IHC(DAB:茶色)のみの対応となります。

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