ISH用RNAプローブ作製について

お客様からの遺伝子情報をもとに in situ ハイブリダイゼーション用として最適なプローブを作製する際の注意事項

• 他の遺伝子にホモロジーがない領域
• 複数の領域でプローブを作製する。
• ゲノム上のリピート配列を含まない領域
• Size：200 ～
• GC%：40％ ～
• アンチセンス鎖が発現している？ もしくは似ている配列はないか？
• RNA合成の鋳型には必ずクローニングしたcDNAを使用する。

STEP1.複数領域を設計する

ORFに限らず、配列全体で設計する

• RNAが高次構造をとっているため、プローブの場所によって染色性が異なる場合がある。
• 複数領域での染色結果を比較することにより、結果の信頼性をあげることができる。
• もっとも染色性の高い領域のプローブを検討する。

STEP2.プローブバリデーション試験（特異性試験）

作製した3つの領域のプローブをもちいて、ポジコンとなる組織でISH試験を行う。

最も特異性の高い領域のプローブを次の本試験に採用する。

	Probe1	Probe2	Probe3
Antisense probe
Sense probe

STEP3.本試験実施（Probe1)

	心臓	大腿骨
Antisense probe
Sense probe