ISH用RNAプローブ作製・バリデーション試験

 

ISH用RNAプローブ作製について

お客様からの遺伝子情報をもとに in situ ハイブリダイゼーション用として最適なプローブを作製する際の注意事項

  • 他の遺伝子にホモロジーがない領域
  • 複数の領域でプローブを作製する。
  • ゲノム上のリピート配列を含まない領域
  • Size:200 ~
  • GC%:40% ~
  • アンチセンス鎖が発現している? もしくは似ている配列はないか?
  • RNA合成の鋳型には必ずクローニングしたcDNAを使用する。

複数領域を設計する

ORFに限らず、配列全体で設計する

probe_orf

  • RNAが高次構造をとっているため、プローブの場所によって染色性が異なる場合がある。
  • 複数領域での染色結果を比較することにより、結果の信頼性をあげることができる。
  • もっとも染色性の高い領域のプローブを検討する。

 

プローブバリデーション試験(特異性試験)

作製した3つの領域のプローブをもちいて、ポジコンとなる組織でISH試験を行う。

最も特異性の高い領域のプローブを次の本試験に採用する。

Probe1 Probe2 Probe3
Antisense
probe
 probe  probe  probe
Sense
probe
 probe  probe  probe

本試験実施(Probe1)

心臓 大腿骨
Antisense
probe
 probe probe
Sense
probe
 probe probe

 

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