凍結薄切の作製について

既固定凍結の場合(固定する場合)

1.固定

摘出した組織は鋭利なカミソリなどを用いて切り出し、固定液に浸漬する
固定はシェーカーなどを用いて室温にて1晩(16時間)程度
*固定液は試験の内容に適したものをご使用ください。 弊社による試験では、組織像につきましては10%NBFが良好な像を得られております。
*筋肉は太すぎると内部の凍結が遅くなります。4mm程度以内程度に納めるのがよろしいかと思われます。

2.洗浄~Sucrose置換

固定終了後は30分間PBSにて洗浄し、Sucrose-PBSに置換する。

固定液

PBSに交換し洗浄 室温 30分

10%Sucrose-PBS 4℃ 2時間程度

20%Sucrose-PBS 4℃ 半日程度

30%Sucrose-PBS 4℃ Overnight

3.凍結

用意するもの

  • 液体窒素
  • イソペンタン
  • 100ml程度の小型のガラスビーカー
  • 小さめの発泡スチロール箱(あまり深さのないもの、あるいは縁を切って浅く加工する)
    一般凍結用のデュワー瓶などもご使用になれますが、深さがありますため液体窒素のモヤで著しく見にくくなり、作業がしにくくなります。
  • モールド
    組織の大きさに合わせてアルミホイルで作成してください。組織に対してあまり大きすぎますと凍結不良の原因となります。組織の周囲5mm程度までがよろしいかと思います。
    プラスチックのモールドは、熱伝導が悪いため凍結速度が遅く、不良の原因となりますので避けてください。
  • 包埋剤 (クリオマウントⅠ低粘度タイプ 武藤化学株式会社)
  • 小皿程度の容器(培養シャーレ、プラスチック計量皿等)
  • チャックつきビニール袋(小)

準備

  1. 発泡スチロール箱に液体窒素を入れる。
  2. ガラスビーカーにイソペンタンを入れる。(半分程度)
  3. 小皿に包埋剤を少量とる。
    凍結用モールドに包埋剤を満たしておく。
  4. 発泡スチロール箱の液体窒素にイソペンタンのビーカーをゆっくり浸け、イソペンタンを冷却する。
    *この操作は準備が全て整ってから行う。イソペンタンの縁が白く氷り始めたら凍結操作に入る。

手順

  1. 切り出し(摘出時にトリミングしている場合は不要)
    組織をSucrose-PBSから取り出し、カミソリで適度な大きさにトリミングする。
  2. 組織表面の水分を除去する。
    整形した組織を、ペーパータオルなどの上で転がし、なるべく水分を除去する。
    組織の周囲に水分が多く残っていると、包埋剤との境界面に水の膜ができ、薄切時に裂けてしまうことがあります。
  3. 組織を包埋剤になじませる。
    小皿に入れた包埋剤に組織を浸し、ピンセットなどでかき混ぜるようにして
    組織表面に十分に包埋剤に馴染ませる。
  4. 組織を取り出し、新しい包埋剤を満たした凍結用モールドに沈める。
    組織はモールドの中心付近に、必ず周囲に余白ができるよう置く。
    モールドの底に軽く押し付けるように設置する。
  5. 凍結する。
    モールドをピンセットでつまみ、液体窒素で十分に冷却されたイソペンタンに入れる。
    この際、ブロックの上表面まで白く凍結するまでモールド内の包埋剤の上部が空気中に露出する状態で保持する。
    いきなり全体を沈めてしまうと凍結の進行に伴い中心部が膨張し、ブロック自体が割れてしまいます。
    全体が白くなればイソペンタンの中にすべて沈める。
    数分した後、ブロックから泡が出なくなれば凍結完了。
    なお、イソペンタンの冷却が過ぎるとビーカーの縁あるいは底面からイソペンタンが凍結してしまいます。
    作業に差し障るようであればビーカーを一旦液体窒素から取り出し、イソペンタンが溶けるのを待って再度続ける。
  6. ラベルし、密封・保管する。
    凍結したブロックを取り出し、ペーパータオルで周囲のイソペンタンを拭い去る。
    サンプル名を記載した紙とともに、チャック付きビニール袋に入れる(乾燥防止)。
    発送まで保管する場合、-80℃にて保管。

発送

ラベルし、密封・保管する
発送の際は、発砲スチロール箱に、十分量の砕いたドライアイスにブロックを埋めた状態で、
弊社まで冷凍便にてお送りください。

未固定凍結の場合

未固定凍結では、凍結部分は上記と同様ですが、以下の点が異なります。

  • 包埋材は OCTコンパウンド(サクラ) をご使用ください。
  • 固定ならびにSucrose置換の操作は行いません。

動物を屠殺後、速やかに組織を摘出し、上記「3.凍結」の「手順 b」より凍結ブロック作成を行ってください。

染色例

凍結切片 筋肉

 

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